澳门金莎娱乐网站 旅游攻略 P.364核酸检验基本技术

P.364核酸检验基本技术

世界自然遗产之一的黄石国家公园地处美国怀俄明洲西北部寒冷的洛基山脉之中,美国大陆分水岭从中穿越。公园占地约8900平方公里,其中包括一个长72公里,宽48公里的巨大休眠火山口,因此当地的地质活动十分活跃,公园境内有超过10,000处地热景观,包括热喷泉,热气井,热泥潭和热温泉。独特的地质环境不仅造就了丰富多彩的自然风光,更孕育了一个千姿百态的生态系统,因此不仅有络绎不绝的游客慕名来访观光,同时也吸引了众多科学家前往考察研究。
在所有的地热景观中,热温泉以其缤纷的色彩最为醒目。科学家发现,这些多变的色彩其实是生活在热温泉中的各种微生物所造成的。在热温泉的泉眼周围,泉水蔓延成环形的泉滩,微生物沉积在水底形成菌苔。微生物体内有不同的生物色素,有的用于进行光合作用,有的用于抵抗紫外线,因此菌苔的颜色将热温泉妆点为一个个五彩的天然调色盘。
黄石国家公园的热温泉在泉眼的温度通常都超过80摄氏度,远高于适于光合作用的温度上限72摄氏度,依靠光合作用为生的微生物无法生存,因此泉眼处缺乏微生物形成的菌苔而显得灰暗。然而,在1967年,印地安那大学的布洛克博士发现,在他放在一个叫做“蘑菇塘”80摄氏度泉水中的载玻片上,附着了一层微生物细胞。这是首次发现生活在72摄氏度以上的生物。这种嗜热微生物属于细菌类,布洛克博士将它命名为“水生嗜热菌黄石一号”。这个发现在当时也就作为一个生存温度记录而已,直到十几年后,它才显出了真正的价值。
在1980年代,随着生化技术的发展,科学家发现并分离纯化了越来越多的生物酶,并开始利用这些酶以及其它的新型技术直接对蛋白质,核酸——包括DNA进行切割、化学修饰等加工,分子生物学以及遗传工程从此飞速发展。酶本身是一类特殊蛋白质,不同的酶在细胞内担任各种生理活动,比如DNA的合成和复制主要由DNA聚合酶来完成。绝大多数酶对温度很敏感,在高温下会不可逆转的失去活性。当时在Cetus公司工作的缪利斯博士从黄石公园的嗜热菌上找到了灵感,既然嗜热菌能够在80摄氏度以上的高温生存,那么嗜热菌细胞内的酶也一定耐高温。据此缪利斯博士发明了开创生命科学研究新局面的聚合酶链反应方法,使人工大量复制DNA成为可能。
DNA是主要的细胞内遗传信息载体,具有双链结构,由其中每一条单链及其姊妹链在化学作用下互相配合而成。在细胞繁殖分裂过程中,DNA也随之进行复制,以使每个子细胞都保持同样的一份遗传信息。细胞内的DNA复制由多种酶的协同作用完成,首先将DNA双链分开,然后DNA聚合酶把每一条DNA单链作为模板,合成并配上与其原来的姐妹链一模一样的新链,从而完成复制过程。将DNA分子加热到接近沸腾的温度也可以分开DNA双链,并且不破坏其化学结构。
缪利斯博士从前人和自己的研究中发现,嗜热菌的DNA聚合酶虽然在接近沸腾的温度下也会失去活性,然而当温度下降后,嗜热菌DNA聚合酶的活性会恢复,不象其它生物来源的聚合酶那样在高温下不可逆失去活性。这样一来,就能够将DNA与嗜热菌的DNA聚合酶放在一起,首先升温使DNA分开为单链,然后降温使嗜热菌的DNA聚合酶恢复活性,在分开的DNA单链上进行复制,循环重复这个升温降温过程,就能够实现1变2,2变4,4变8的指数DNA增产。这就是缪利斯博士发明的PCR方法。
这个方法是分子生物学技术的一次革命,从此科学家得以无限制的对极微量的DNA样本进行复制,进而得到大量的纯质DNA进行分析或用作其它实验的材料。PCR已经成为几乎所有与DNA有关的分子生物研究的基础手段,包括遗传病鉴别,传染病原鉴别,人类基因组工程,法医鉴定,亲子鉴定,基因工程食品等领域。
缪利斯博士本人由于发明PCR技术而名利双收,不仅在1993年获得诺贝尔奖,而且PCR的专利收益使他成为一个大富豪,从1991年至今,仅嗜热菌DNA聚合酶生产一项,年销售额已经从2亿美元升至5亿美元。然而由于美国法律规定国家公园要无偿服务于科学界,时至今日,原产嗜热菌的黄石国家公园没有从中得到任何分成,而当年嗜热菌在1967年所打破的生物耐热记录,也在不久以后被在海底发现的113摄氏度下生活的超嗜热菌打破,今年8月公布的在太平洋底发现的超嗜热菌“菌株121”则将此记录提高到121摄氏度。
只有斑斓的温泉还是一如既往的吸引了一代又一代游客,以及不断追求新进展的科学家。在嗜热菌之后,科学家们从黄石国家公园的热床中又发现了许多新的耐热微生物,其中一种能够将垃圾中的多种塑料成分转化为醇类燃料,有希望在将来为人类提供新的能源。也许下一个革命性的生物技术又将从黄石公园或世界其他地方的某个热温泉中产生呢。

第一节 分子生物学基本知识

2003.12.17

一、DNA与RNA

<u>DNA</u> 脱氧核糖核酸
遗传信息–核苷酸排列顺序、以碱基互补维持双螺旋结构
DNA为<u>长丝状分子</u>互相纠缠、其溶液十分黏稠
溶液对<u>紫外线</u>有最强吸收、用<u>260
nm波长</u>测DNA溶液浓度。DNA变性后OD值会↑
因DNA不溶于乙醇、常用<u>二倍量乙醇</u>沉淀DNA
在<u>变性温度</u>时、黏性突然降低。
淬火–为了保持DNA单链状态
DNA变性后溶液冷却、DNA会<u>自动恢复双螺旋结构</u>


<u>RNA</u> 核糖核酸
起遗传信息传递作用&指导合成蛋白质
病毒中RNA也保存遗传信息

  • 含有核糖、不是脱氧核糖
  • 胸腺嘧啶都代之以尿嘧啶

二、DNA的复制和修复

限制性核酸内切酶–不是合成DNA的必要条件
DNA多聚酶:DNA合成中、单核苷酸分子以共价链连接在3’末端的羟基上。
大肠菌DNA修复:<u>填补缺口</u>最重要的酶–DNA聚合酶Ⅰ(<u>Klenow片段没有5’-3’外切酶活性</u>)意义:保证合成DNA时的准确性
<u>DNA复制最主要的酶</u>–<u>DNA聚合酶Ⅲ</u>(具有3’-5’外切酶活性的<u>亚基是:ε亚基</u>)

三、转录

DNA指导的RNA合成过程。
DNA双链解旋,解旋部位称启动子
大肠菌<u>RNA</u>聚合酶有<u>5个亚基、
σ亚基有启动子作用</u>

四、翻译

  • tRNA:搬运氨基酸
  • rRNA:构成核糖体骨架 ribosome
  • mRNA:决定蛋白质结构

DNA3个终止密码子:UAA、UAG、UGA
真核生物 核糖体 的<u>5种组蛋白、H1</u>在进化中最不保守。
核糖体上、2个位置上暴露出mRNA分子相邻的2个密码子(蛋白质合成结束?我不懂

第二节 分子生物学基本技术

一、质粒DNA的分离、纯化和鉴定

质粒–染色体外的稳定遗传因子。
<u>大小从
1~200kb</u>、为双链、闭环的DNA分子,超螺旋状态在细胞中。
具有<u>自主复制和转录能力</u>。
细菌质粒是常用载体、质粒载体是天然质粒的基础上人工构建的。
相比天然质粒、质粒载体带有选择性标记基因和人工的含多个限制性内切酶识别点位的多克隆位点序列。
理想克隆载体的特性:

  1. 分子量小、多拷贝、松弛控制型
  2. 具有多种常用限制性内切酶的单切点
  3. 能插入较大的<u>外源DNA片段</u>
  4. 具有容易操作的<u>检测表型</u>

<u>常用质粒载体大小1~10kb</u>
细菌中分离质粒DNA的3个基本步骤

  1. 培养细菌使质粒扩增
  2. 收集和裂解细胞
  3. 分离和纯化质粒DNA

<u>加入抑制蛋白质合成的抗生素、细菌停止繁殖后质粒仍然在复制→提高质粒的收获量。</u>
<u>溶菌酶</u>破坏菌体细胞壁→十二烷基磺酸钠<u>(SDS)和Triton
X-100裂解细胞膜</u>→用强热、酸、碱处理→细菌的线性染色体DNA变性、质粒的共价闭合环状DNA双链不会分开→外界条件恢复→线性染色体DNA片段难以复性、而质粒DNA双链恢复超螺旋分子→溶解状态于液相中
离心除去DNA片段和细胞碎片→酚处理除去核酸酶等蛋白质→乙醇沉积→将质粒DNA从上清液沉积下来→获得高浓度的质粒溶液
超螺旋DNA、提取过程还会产生开环DNA–松弛型环状分子(双链中有1条发生断裂)

标签:, , , ,

相关文章

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注

网站地图xml地图